疾病檢驗讓病原體無所遁形

近年來許多令人聞風喪膽的傳染病不時出現，相信臺灣的民眾都不會忘記 2003 年 SARS 肆虐的情形；原本只會感染家禽的禽流感，也頻頻傳出感染人類的案例。這些難以預測的病毒，比任何武器都強悍、可怕，因此當前有許多科學家，致力於研製消滅與預防這些致命疾病的藥劑。另一方面，為了讓這些病毒無所遁形，開發出快速、準確的檢驗試劑也是刻不容緩的工作，當然檢驗試劑的經濟價值也會隨著水漲船高。

根據美國的研究調查，在 2000 年全球體外診斷試劑市場已達 233 億美元，同時每年以約 7％ 的幅度向上攀升。在臺灣，許多廠商也紛紛投入檢驗試劑的研發製造，光是近五年來，投入檢驗試劑領域的臺灣生技廠商就多達 20 家以上。檢驗試劑的種類，從疾病檢驗、驗孕、驗血型，到測試公共場所販售的飲料是否含有禁藥等。隨著人類對傳染性疾病預防監控觀念的日漸重視，檢驗試劑的需求也逐漸擴大。

傳染性疾病的檢驗，要從找出病原體開始。病原體是引起疾病的微小生物，一旦確定病患體內的病原體為何，才能對症下藥。辨識病原體和辨認一個人一樣，必須找到這個人的外型特徵，張三有鬍子，李四嘴角有個痣，藉由辨識病原體的特殊標記，就可以確認該病原體了。一般用來辨識的標記有三種型態，分別是 DNA、信使 RNA（messenger RNA, mRNA）以及蛋白質。我們就先從認識 DNA 到合成蛋白質的過程開始吧！

從基因到蛋白質

生物的遺傳物質去氧核醣核酸（DNA），是構成細胞核中染色體的基本成分，它是由磷酸根、五碳核醣與含氮鹼基所組成的。含氮鹼基有四種：腺嘌呤（adenine，簡稱為Ａ）、鳥糞嘌呤（guanine，簡稱為Ｇ）、胸腺嘧啶（thymine，簡稱為Ｔ）和胞嘧啶（cytosine，簡稱為Ｃ）。

鹼基之間可以形成固定的配對關係，Ａ跟Ｔ配對，Ｇ跟Ｃ配對。在染色體中，兩條 DNA 序列藉由這配對原則排列，構成由華生（James Watson）和克立克（Francis Crick）在 1953 年發表的著名雙螺旋結構。這樣的 DNA 結構除了可以確保遺傳訊息絲毫無誤地傳遞給下一代，也是使基因能夠發揮功能的機制。

基因要能夠發揮功能，必須根據 DNA 訊號合成有活性的蛋白質。細胞從 DNA 訊號到合成蛋白質的過程，需要經過轉錄與轉譯兩個步驟。首先基因的 DNA 序列先轉錄成信使 RNA，兩者的關係是互相配對的。信使 RNA 是由核醣核酸（RNA）構成，RNA 和 DNA 相似，也有四個不同的鹼基，不同處在 RNA 以尿嘧啶（uracil，簡稱為Ｕ）取代Ｔ，和Ａ形成配對，因此 DNA 上的Ａ會轉錄為信使 RNA上的Ｕ。

當細胞啟動某一蛋白質的基因時，DNA 的雙股結構就會分開，RNA 聚合酶便開始轉錄的動作，製造信使 RNA。信使 RNA 在核醣體中做為模板，由另一個酵素把「RNA 的語言」轉譯成「蛋白質的語言」。信使 RNA 上的序列會把每三個含氮鹼基歸為一組，每一組會轉譯成一種特定的胺基酸，根據不同的順序把胺基酸連在一起，就形成了不同的蛋白質。

不同的病原體有其特定的基因組合，再怎麼相似的病原體，也會有不同的基因。這些基因可以轉錄成特有的信使 RNA，以及轉譯成專一的蛋白質。病原體入侵人體時，必然會有這些物質的痕跡，藉由檢驗每個病原體特有的 DNA、信使 RNA 或蛋白質，就可以判斷病患感染了哪一種病原體。因此，可以利用這三種生物分子的特性，發展出檢驗各種不同疾病的利器。接下來介紹根據這三種物質而開發出來的各種檢驗方法。

DNA 與 RNA 的檢測

DNA 和 RNA 中鹼基間的配對關係，經常用來鑑定特殊的基因序列。其中的原理就是，先製備和檢驗病原體中特定 DNA 序列互補的 DNA，以它為探針去搜尋欲檢驗的 DNA 序列。在生化的研究上經常不斷地運用這個策略，以下介紹一些目前常用的方法。

聚合酶連鎖反應：檢驗病原體經常遭遇的問題，就是病原體的數量不夠，需要數日的培養，等到病原體到達一定的數量後，才可以檢測。如此一來，曠日廢時，病情可能因此被延誤了。聚合酶連鎖反應的發明，使得我們可以大幅縮短檢驗的時間。聚合酶連鎖反應是穆里斯（Kary B. Mullis）於 1983 年發明的，他也因為這項發明獲得了 1993 年諾貝爾化學獎。

聚合酶連鎖反應可以在短時間內大量複製特定基因片段。在進行聚合酶連鎖反應前，要先加入 DNA 聚合酶及引子（primer）。DNA 聚合酶是用來催化 DNA 複製反應的進行，使反應速率加快。引子是一段特定的寡核酸序列，與 DNA 序列中的某片段互補，用來啟動 DNA 的合成反應。聚合酶連鎖反應開始時要提高溫度，使 DNA 雙股分離，冷卻之後，引子會和剛分離的特定單股 DNA 序列結合。

DNA 聚合酶利用單股 DNA 序列為模板，從引子處接上去氧核醣核酸，開始進行複製 DNA 序列的工作，使得基因的數目增加一倍。重複這個步驟，可以使得 DNA 的數目不斷倍增，直到能夠被偵測為止。

信使 RNA 雖然也是一種檢測病原體的標的，但是信使 RNA 容易分解，不像 DNA 那麼穩定，保存不易。這時可以利用反轉錄酶以信使 RNA 為模板，合成與它互補的 cDNA（complement DNA），再配合聚合酶連鎖反應大量增殖 cDNA 序列，就可以利用少量的信使 RNA 檢體，偵測到病原體的存在。這個方法也稱為反轉錄聚合酶連鎖反應。

生物晶片：近來發展迅速的生物晶片，是檢測生物分子的利器。生物晶片是在小面積的基材上，完成大量生物性相關檢測的方法，具有快速、高準確度、高靈敏度、同時檢測大量樣本等優點。生物晶片通常利用玻璃片、尼龍薄膜等材料為基材，再利用精密的點陣技術，把所需檢測的大分子點置於處理好的基材上做為探針，可用來檢測 DNA、RNA、蛋白質，甚至細胞等。

基因晶片是目前發展較成熟的一種生物晶片，常用於檢測病原體的 DNA 或信使 RNA。把與病原體特殊基因序列互補的 DNA，高密度地固定在基材上做為探針，利用鹼基互相配對的性質，當檢測液流過晶片時，含有與探針互補的 DNA 序列，就會產生連結而滯留在基材上，這項反應稱為雜合反應。

產生雜合反應後，清洗掉沒有發生雜合反應的樣本 DNA，只留下和探針互補的 DNA 序列。由於 DNA 序列會事先接上可偵測的標記物，通常是螢光或放射物質，這時會有螢光或放射影像的反應，掃描後以電腦分析，就可得知待測物中是否含有實驗者所欲檢測的物質。

基因晶片的好處是可以同時檢驗數以萬計的檢體，也可以同時檢驗數十種病原體。例如，當我們感冒時有時候會發燒，引起發燒的病原體種類相當多，而每一種病原體的治療方式及用藥也不盡相同，因此判定病人的發燒由何種病原體引起，是相當重要的。

大家應該還記得在 SARS 期間，只要周遭有人發燒，就引起大家的恐慌，由於檢驗須花費數日，這段期間發燒的病人必須隔離，而曾經和病患接觸過的人同時也處在恐懼之中。「發燒晶片」的發明可以有效解決這個問題。在發燒晶片上，事先布植各種引起發燒的病原體 DNA 探針，只要取病人咽喉中黏液製作檢測樣本 DNA，流過發燒晶片，藉由晶片中發亮的位置，就可以判定是何種疾病引起的發燒反應。配合聚合酶連鎖反應及反轉錄聚合酶連鎖反應，還可以增加檢測的靈敏度。

蛋白質的檢測法

蛋白質的檢測經常是利用抗體來進行。當人體受到外來的病原體攻擊而產生免疫反應時，促使Ｂ淋巴細胞產生的抗體，可用以辨識這些外來的病原體。抗體辨識的主要目標是病原體的蛋白質，抗體可以和所辨識的蛋白質產生高度專一性的結合，就像鑰匙與鎖的關係。利用這特性，便可以開發出免疫檢驗試劑。

免疫檢驗試劑：免疫檢驗試劑，顧名思義是指利用抗體與抗原結合所產生的免疫專一性反應，定性或定量分析檢體中抗原或抗體的測試劑。目前有許多利用免疫化學原理做成的快速免疫檢驗試劑，其中包括酵素免疫分析法、酵素連結免疫吸附分析法（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）、螢光免疫分析法、免疫沉澱和移動式免疫檢驗法等。

酵素免疫連結分析法是使用酵素標記的抗體（或抗原）來偵測的方法。這方法是先使抗體（或抗原）吸附在固相基材上，再把酵素標記物與抗原（或抗體）結合，進而產生有色的產物。偵測這酵素反應包括顏色、螢光或化學光等，利用顏色深淺來反映樣品中抗原或抗體的量，這種方法可用來偵測荷爾蒙、藥物濫用、環境污染物、傳染性疾病和微生物毒素等。

三明治免疫分析法是一種常用的 ELISA 檢定方式。首先把抗體甲固定在固相基質上，再加入待測樣品，這時待測蛋白質會結合在抗體甲上，其他不相干的蛋白質則不會和抗體甲結合。把其他不會吸附在抗體甲上的蛋白質清洗掉，再加入也會和待測蛋白質結合的抗體乙，則會與待測抗原形成專一性的結合。最後，加入會和抗體乙結合的「二次抗體－酵素連結體」，就使得這些酵素留在基材上。利用酵素所產生的顏色深淺來測定固相基材上所留的酵素量，就可得知樣品中待測蛋白質的量（和酵素量成正比）。

這方法的專一性極強，因為樣品進行了兩次專一性辨認（抗體甲與抗體乙），因此檢驗的準確性很高，同時靈敏度也極大。缺點是耗費時間，無法達到大眾化的快速檢驗要求。

相較於酵素連結免疫吸附分析法，其操作時除了添加待測樣品外，尚需加入其他的抗體或標記物，且需繁瑣的清洗步驟。移動式免疫檢驗試劑，在產品製作時已預先把所有的反應試劑置於載體上，使用時不需添加任何試劑，吸入待測樣品後，就可迅速判讀結果，因此又稱為「單一步驟移動免疫檢驗法」。

這種單一步驟免疫檢驗法方便、快速，是目前檢驗試劑界應用最廣的技術，包括市面上普及的驗孕試劑、排卵試劑，以及全球生技廠商致力研發的癌症試劑、傳染病試劑、禁用藥物試劑、心臟病診斷試劑等，都是採用這套技術衍生發展而成的。

蛋白質晶片：蛋白質晶片原理與基因晶片相同，差別只在於把探針改為蛋白質，可以偵測蛋白質－蛋白質、抗原－抗體、酵素－受質間的專一性結合。把蛋白質、抗體或酵素當做探針固定在晶片基材上，和檢測樣本接觸，如果檢測樣本中含有能與探針結合的物質，就能夠發生反應。

在蛋白質晶片中，有一種可以偵測其反應結果的方法，叫做表面電漿共振法，這方法快速而且靈敏，成為近年來許多研究的重點。

表面電漿共振法：所謂表面電漿共振是一種光學現象，當光束從一個介質傳導到另一個介質時，會發生反射與折射的現象。如果光線從高折射率介質進入低折射率介質，在入射角超過某個角度時，會造成全反射的現象。雖然這時不會有任何能量穿越兩種介質的交界面，但由於光束的電子振盪和金屬薄層內金屬原子產生共振作用時，光束仍會以電流的方式，向低折射率介質的方向洩漏一些能量，使得在特定的反射角範圍內，引起反射強度的急遽變化。這角度稱為共振角，它會隨著低折射率介質的折射率改變而有所變化。

表面薄膜共振法：表面薄膜共振法通常是在鍍金的玻璃上接上探針，當檢體經過時，如果裡面含有會和探針結合的物質，就會改變表面的折射率，進而影響共振角。藉由共振角的改變，可以偵測待測檢體中是否有能和探針結合的成分，同時共振角的改變和結合於探針上的檢體量有一定的關係，因此也可以做為定量的工具。這方法可以進行立即、連續的偵測，檢體也不需要做任何標誌。

有些疾病的病毒極易產生變異，因此病毒的種類越來越多，也讓人們更加難以捉摸。當人們受到不知名病毒感染時，如何快速準確地確定病毒種類，格外顯得重要。以上所提的各種原理，許多已應用在醫學檢驗上，有了這些檢驗試劑的開發，一旦 SARS 或禽流感等流行性疾病伺機而動時，就可以儘早發現、儘早治療，避免疫情擴大。另外在生技醫藥產業中，檢驗試劑的研發投資較少、進入障礙較低、回收時間較快，因此十分受到國內業者青睞，檢驗試劑的發展前途未可限量。