受傷DNA修復的觀察

看到細胞修復的過程

由於臭氧層的破壞日趨嚴重，人類受日光中紫外線照射的機率也隨著增加。紫外線會傷害細胞內的去氧核醣核酸（DNA），若不加以修護，可能導致基因突變或癌症的發生。幸好人類細胞有一套修復機制，可修復這種因紫外線照射所造成的DNA傷害。最近有一項漸受研究者採用的實驗技術－－微孔紫外線照射（micropore UV irradiation），這項實驗技術配合一般免疫螢光染色法，便可以觀察修復機制在細胞中運作的情形。

微孔紫外線照射技術最初是由日本森俊雄（Toshio Mori）博士及其同仁於 2001 年提出的（J. Invest. Dermatol. 117（2001）1156−1161），他們利用實驗室常用的濾膜（平時用來過濾分子或細菌）做為濾鏡，讓紫外線只能穿過 3 ~ 5 微米（μm）的孔洞，使得被照細胞的 DNA 只有局部受傷，再輔以傳統的免疫螢光染色，就可以觀察到不同時間及空間下活細胞 DNA 受傷後的修補過程。

細胞的自我修復機制

過度曝曬紫外線除了造成皮膚變黑與老化之外，也可能導致基因突變或細胞癌化。當細胞受到短波長紫外線照射後，會產生兩種主要的 DNA 傷害，即環丁嘧啶二聚體（簡稱 CPD）和嘧啶 6−4 二聚體（簡稱 6−4PP），這二者都是 DNA 分子鹼基（嘧啶）間異常的鍵結物。

細胞中有一套修復機制，即核酸切割修補（nucleotide excision repair, NER），能夠修復這些 DNA 傷害。NER 是一種由一系列修復蛋白質所參與的機制，當 DNA 傷害產生後，修復蛋白便會前去辨識，再經由切除、填補、黏合等步驟完成修復。

幫助細胞修復

在人群中有些人帶著體隱性遺傳疾病，例如色素性乾皮症（Xeroderma Pigmentosum, XP），由於缺乏某種正常的 NER 基因，無法像正常人一樣修復這些 DNA 傷害，因此他們對光照非常敏感。這些 XP 病患除了有皮膚癌高罹患率的顧慮外，也容易有其他體內器官癌變的隱憂。過去學者在研究細胞中的 DNA 修復機制時，由於傷害範圍太大無法清楚觀察細胞的修復運作，現在因為有微孔紫外線照射技術，上述的困擾就得以解決。

我們可以藉由這種技術，僅允許部分紫外線從濾膜上的小孔洞穿過，把 DNA 傷害局限在核的某一小區域，以便觀察修復蛋白集合到傷害區域的情形。藉上述方法對細胞進行微孔紫外線照射之後，移除濾膜讓細胞修護一段時間，再利用可以辨識 CPD 或 6−4PP 的抗體，或者是修復蛋白的抗體進行免疫螢光染色，以便觀察 DNA 損壞與修復蛋白共位（co-localization）的情形。

免疫螢光染色法是先以專一性高的一級抗體來辨識標的物，再給予帶有螢光的二級抗體來辨識一級抗體，如此，經由觀察螢光顯微鏡所看到的螢光訊號，便可以找到標的物的位置。

DNA 修復過程的實例

以人類纖維母細胞 MSU−1 為實驗材料，在薄膜覆蓋下進行微孔紫外線照射（波長 254 奈米，能量密度是 100 焦耳／平方公尺），30 分鐘後，利用 CPD 抗體和修復蛋白 XPB 抗體進行螢光染色。XPB 具有核酸解旋酶活性，在 NER 過程中負責解開 DNA 雙股螺旋以利切除傷害的部位。

首先對某一視野的所有細胞核以 DAPI 染色，DAPI 是一種有機小分子，可以插入雙股 DNA 的溝槽中形成 DNA−DAPI 複合物，由於它會吸收特定波長而釋放藍色螢光，因此可用來確定 DNA 的位置。接著在同一視野內以 CPD 抗體螢光染色，因其二級抗體帶有釋放紅色螢光的探針，所以訊號是紅色。當部分細胞核內含紅色顆粒狀螢光訊號時，就表示細胞核受到局部傷害。

在同一視野內再以 XPB 抗體螢光染色，因其二級抗體帶有釋放綠色螢光的探針，所以它的訊號是綠色，受傷部分的細胞核內會呈現顆粒狀綠色訊號。把利用 CPD 染色的照片與利用 XPB 染色的照片重疊，照片上的綠色訊號和紅色訊號恰好在同一位置，表示 XPB 和 CPD 的位置是一致的，因此可知 MSU−1 細胞經紫外線照射後，隔 30 分鐘就有修復蛋白 XPB 到 DNA 損害處進行修復。
以中國倉鼠卵巢細胞 CHO−KI 及帶有 NER 缺陷的同源細胞株 UV24 做為實驗材料，進行紫外線局部照射。這二種實驗材料經紫外線照射後，立刻用 6−4PP 抗體進行免疫螢光染色，可以看到細胞受到局部傷害的訊號。若讓細胞經過九小時的修復，便已無法在 CHO−KI 中偵測到 6−4PP 的訊號。然而以同樣方式處理 UV24 細胞，6−4PP 的螢光訊號仍然存在，顯示 CHO−KI 在這段時間可以完全修復細胞的 6−4PP 傷害，UV24 細胞則不能。